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宋保亮（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室,上海,200031）
戚炜（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室,上海,200031;南京大学生物科学与技术系,南京,210093）
李伯良（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室,上海,200031）
摘 要：操作含长插入片段的DNA克隆时, 经常需要进行亚克隆和测序实验. 通常的方法首先是得到插入片段的限制性内切酶谱, 然后选择合适的内切酶消化DNA,
分离靶片段, 将其连接入质粒载体中进行下一步操作. 但这种方法工作量大, 步骤繁琐. 在此, 介绍一种不需要做限制性内切酶谱分析, 而根据靶片段的旁侧序列直接进行亚克隆实验的方法.
首先, 选择合适的限制性内切酶消化含长插入片段的DNA克隆, 其中一种酶切在已知的旁侧序列上, 另一为随机选择; 然后酶切混合物与线性化的质粒载体连接,
转化细菌得到一"亚克隆库"; 将其中的克隆挑选入96孔板培养后, 按行或列混合菌液得到相应的"pool";
最后, 用PCR方法筛选获得含靶DNA片段的阳性克隆, 其中所用的引物一个与已知的旁侧DNA序列配对, 另一个与质粒载体上序列配对, PCR扩增已知的旁侧DNA片段以鉴定阳性克隆.
多次独立实验表明该方法简单有效, 可广泛用于亚克隆和DNA步移实验.
关键词：亚克隆; 筛选; 步移; ACAT (2002.11.19)
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